信帆生物為您分享：ELISA實驗中常見的問題以及解決方法
elisa 試驗以靈敏度較高、特異性較好的特點在上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，有可能導致顯色不全、花板等結(jié)果。我將操作中各個環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下，以期給同行帶來一些啟發(fā)，提高試驗質(zhì)量。
下面分析Elisa試驗操作中可能影響結(jié)果的原因，并給出相應(yīng)的解決辦法
1. 選擇試劑
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行操作，操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。
2 加樣
可能原因： ① 血清或血漿標本分離不好即進行加樣; ② 手工操作中，加樣板過多造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時); ③ 加完標本再加酶試劑時酶濺出孔外。解決辦法： ① 標本為血清：將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘;標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。 ② 加樣后及時放入孵箱。 ③ 加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。④ 如果采用AT或其他全自動加樣，選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 ⑤ 標本較多時，請分批操作。
3. 孵育
可能原因： ① 孵育時未貼封片或加蓋，使標本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗*; ② 孵育時間人為延長，導致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。解決辦法：① 貼封片或加蓋; ② 按說明步驟嚴格控制操作時間。
4. 洗板
可能原因： ①采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。 ② 采用半自動洗板機洗板時，洗液量不足，導致洗板不*;洗板針堵塞，抽吸不*;洗板不暢，導致洗板效果差。 ③ 反應(yīng)板過多造成洗板等待時間長。 解決辦法： ① 保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干; ② 合理安排，或多用幾臺洗板機。
5. 顯色
可能原因： ① 顯色劑配制后放置時間過長或使用過期顯色劑; ②加顯色劑時濺出孔外造成液體回流。解決辦法： ① 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用; ② 加樣時保持顯色劑不外流; ③ A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。
6. 終止
可能原因如加終止液時產(chǎn)生較多氣泡，導致假陽性增加。所以在加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
7. 讀板
如讀板時板底不清潔等。應(yīng)保證酶標板清潔。
所以在整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸;盡可能實現(xiàn)ELISA檢測標準自動化，有效提高檢測質(zhì)量。
在實際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴格按照操作步驟進行操作，同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L檢測每一份標本，才能保證檢測質(zhì)量。現(xiàn)在國內(nèi)已有相當數(shù)量的單位擁有全自動酶標儀，這對于實現(xiàn)ELISA標準化檢測、提高檢測質(zhì)量起到了重要作用。
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